Đưa vào hoạt động từ giữa năm 1941, chiếc Ki-49 tham chiến đầu tiên tại Trung Hoa. Sau khi Chiến tranh tại Thái Bình Dương nổ ra, nó hoạt động tại khu vực New Guinea và không kích vào Australia. Giống như chiếc nguyên mẫu, những phiên bản ban đầu được tranh bị năm súng máy 7,7 mm (0,303 in) và một pháo 20 mm. Kinh nghiệm chiến đấu tại Trung Hoa và New Guinea cho thấy chiếc Donryu có động cơ không đủ mạnh ảnh hưởng đến tải trọng bom và tốc độ. Do đó, đến đầu năm 1942 một phiên bản nâng cấp động cơ được chế tạo, gắn động cơ Ha-109 mạnh hơn, và nó được đặt tên Máy bay Ném bom hạng nặng Lục quân Loại 100 Kiểu 2 hoặc Ki-49-IIa. Kiểu 2 cũng có vỏ giáp được cải tiến và thùng nhiên liệu tự hàn kín và được tiếp theo sau bởi kiểu Ki-49-IIb trong đó súng máy 12,7 mm (0,5 in) được sử dụng thay cho kiểu 7,7 mm (0,303 in).

Tuy vậy, cho dù có tất cả các cải tiến đó, lượng máy bay tổn thất tiếp tục gia tăng vì số lượng và chất lượng của những máy bay tiêm kích đối địch ngày càng được tăng cường. Một cố gắng ngăn chặn thất bại vào đầu năm 1943 bằng cách nâng cấp thêm động cơ, nhưng không thể thực hiện được vì những khó khăn trong việc phát triển kiểu động cơ Nakajima Ha-117 2.420 mã lực (1.805 kW) và kiểu Ki-49-III không thể đưa vào sản xuất và chỉ có sáu chiếc nguyên mẫu được chế tạo.

Vì tính chất dễ bị thương tổn ngày càng tăng do đối địch khi thực hiện các nhiệm vụ được thiết kế, Ki-49 được sử dụng trong các vai trò khác tại Thái Bình Dương cho đến khi chấm dứt chiến tranh, bao gồm tuần tra chiến tranh chống tàu ngầm, vận tải, và cuối cùng là các phi vụ cảm tử kamikaze. Có 819 máy bay được hoàn tất, và việc sản xuất kết thúc vào tháng 12 năm 1944.